CASTILLO HERNANDEZ, SANDRA LORUHAMA (2014) Extractos de cítricos como inhibidores del "quórum sensing" en campylobacter jejuni y su efecto sobre algunos factores de virulencia relacionados. Doctoral thesis, Universidad Autónoma de Nuevo León.

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Abstract

El Quórum Sensing (QS) es un sistema de señalización presente en bacterias que tiene influencia en una gran variedad de factores de virulencia. En el presente estudio se investigó la habilidad de extractos de cítricos para inhibir la actividad AI-2 del QS en Campylobacter jejuni y su habilidad para inhibir la movilidad, la formación de biopelículas, la capacidad de adhesión e invasión de Campylobacter a células HeLa y el efecto sobre la expresión de los genes: flaA, flaB (relacionados con la movilidad y formación de biopelícula), y ciaB y cadF (relacionados con adhesión e invasión). Se prepararon extractos acuosos de cáscara y bagazo de diferentes cítricos, se determinó la actividad antimicrobiana en pozo y la concentración mínima bactericida (CMB) contra C. jejuni. Se eligieron los extractos de C. limon, C. aurantium, C. medica por presentar las CMBs más bajas, oscilando entre 1.5 y 3mg/ml, utilizándose para los estudios posteriores. Se evaluó también el efecto de estos extractos sobre la formación de biopelícula de C. jejuni en microplacas de 96 pozos, donde se cultivó C. jejuni con y sin tratamiento con extracto. Se tiñó la biopelícula con safranina, y se midió la absorbancia en un lector de ELISA para determinar la cantidad de biopelícula formada, encontrándose una reducción concentración-dependiente en la mayoría de los casos. Para determinar el efecto sobre la movilidad de C. jejuni, se prepararon placas con 0.3% de agar Muller Hinton, se sembró en el centro una alícuota de C. jejuni previamente activada, se incubaron a 42oC/48h en las mismas condiciones y se midieron los halos de migración encontrándose una reducción por efecto de los extractos hasta en un 40%. Para relacionar la influencia de los extractos sobre el QS, se obtuvieron sobrenadantes de cultivos de C. jejuni y se mezclaron con los extractos. Se agregaron a los cultivos de V. harveyi BB170 y se midió la bioluminiscencia emitida. Se encontró que la actividad AI-2 del QS disminuyó significativamente comparado con el control después de la adición de extractos. Al realizar los ensayos de adherencia e invasión a células se encontró que la capacidad de adhesión de C. jejuni, no se redujo por efecto de los extractos; sin embargo, la invasión disminuyó en células tratadas con extracto comparadas con las no tratadas. Al determinar el efecto de la adición de extractos sobre la expresión de los genes de virulencia relacionados, se evidenció una disminución en la expresión de los genes flaA, flaB, cadF y ciaB en la mayoría de los casos. ABSTRACT Quorum Sensing (QS), a signaling system present in bacteria, is able to influence the expression of a variety of virulence factors. Substances capable of interfering with QS could be alternate mechanisms for targeting virulence, and as result, control of the pathogenic microorganisms or the disease it causes. This study investigated the effect of citrus extracts, and their influence on the activity of AI-2 molecules responsible of QS in C. jejuni and their influence on virulence processes such as motility, biofilm formation, adherence, invasion and expression of flaA-B, ciaB and cadF. Cultures of Campylobacter jejuni were exposed to various concentrations of citrus peel extracts (lime, citron and bitter orange). To test swarm motility, concentrations lower than the MBC of the citrus extracts, were mixed with Muller Hinton (0.3% agar). C. jejuni was placed in the center of the plate and after incubation, the extent of swarming motility was determined by measuring the diameter of migration and compared with control. Biofilm formation on polystyrene microtiter plates with Brucella broth was quantified at O.D. 492nm after staining with safranin. AI-2 activity was determined from supernatants of C. jejuni cultured in Brucella broth, which were added into fresh culture of V.harveyi BB170 (on AB medium) using a bioluminescence assay. Culture supernatants of V. harveyi BB152 were used as positive control. Adherence and invasion were measured using HeLa cells assay and the levels of expression of flaA-B, ciaB and cadF were determined by qRTPCR before and after addition of citrus extracts. Results showed that swarm motility was reduced 50% when treated with lime or citron extract, and 35 to 40% for bitter orange extract. Citric extracts reduced by 60 to 75% biofilm formation depending on extract concentration and/or Campylobacter strain tested. Citrus extracts decreased AI-2 activity in most cases at levels of 90% Relative Light Units (RLU). All extracts at 75% of MBC reduced (P≤0.05) the expression of flaA-B, ciaB and cadF and invasion of C. jejuni to HeLa cells. This study provides an insight of the effect of natural edible antimicrobials on QS and virulence factors of Campylobacter jejuni.

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